دانشگاه آزاد اسلامي واحد دامغان
پايان نامه کارشناسي ارشد
دانشکده کشاورزي
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد در رشته مهندسي کشاورزي
گرايش بيوتکنولوژي
عنوان :
مطالعه اثر باکتريهاي محرک رشد گياهي بر ريشه زايي و سازگاري گياه پپروميا
استاد راهنما :
جناب آقاي دکتر احمد عليمددي
اساتيد مشاور :
سرکار خانم دکتر بهاره کاشفي
جناب آقاي مهندس سيد علي قائم مقامي
نگارنده :
سحر مهدوي ايگدلو
شهريور 92
سپاسگزاري:
با سپاس از پدر و مادر عزيزم به خاطر حمايتها و تشويقهاي دلگرم کننده شان
با سپاس از استاد راهنماي گرانقدرم جناب آقاي دکتر احمد عليمددي و همچنين همسر گرامي ايشان سرکار خانم دکتر رستمزا
با سپاس از اساتيد مشاور محترم سرکار خانم دکتر بهاره کاشفي و جناب آقاي مهندس سيد علي قائم مقامي
و با سپاس از جناب آقاي دکتر احمد اصغرزاده عضو هيات علمي موسسه تحقيقات خاک و آب کشور (براي تهيه سويههاي باکتريايي)
فهرست مطالب
فصل اول: کليات تحقيق2
1-1 گياهشناسي پپروميا2
1-2 نگهداري گياه پپروميا2
1-3 نقش کشت بافت در تکثير گياهان3
1-4 ترکيبات محيطهاي کشت5
1- 4 – 1 مواد غير آلي6
1- 4- 2 منبع کربن6
1 – 4 – 3 ويتامينها6
1 – 4 – 4 آمينواسيدها و مکملهاي آلي7
1 – 4- 5 تنظيم کنندههاي رشد گياهي7
1 – 4 – 6 عامل ژلهايکننده7
1- 4 – 6 – 1 آگار7
1-5 ظروف کشت8
1 – 6 انتخاب و تهيه ريزنمونه8
1 – 7 ريزازديادي8
1-8 کودهاي زيستي9
1-9 باکتريهاي محرک رشد گياه (PGPRها)9
1-10 مکانيسم عمل PGPR ها11
1-10-1 نقش مستقيم PGPRها12
1-10-2 نقش غيرمستقيم PGPRها13
1-11 اهداف تحقيق13
فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده15
2- 1 سوابق استفاده از PGPR در کشت بافت ساير گياهان15
2- 2 سوابق استفاده از PGPR در کشاورزي15
فصل سوم: مواد و روشها22
3 – 1 محل انجام آزمايش22
3 – 2 تهيه گياه مادري22
3-3 تهيه و واکشت سويههاي باکتريايي22
3-4 ترکيبات و ساخت محيط کشت23
3-5 ضدعفوني ريزنمونههاي گياهي پپروميا24
3-6 شرايط کشت ريزنمونهها26
3-7 کشت اوليه26
3-8 آزمايش بررسي اثر استفاده از تيمارهاي مختلف گندزدايي در جلوگيري از آلودگي در کشت بافت گياه پپروميا26
3-9 بررسي تاثير افزايش غلظت فسفر بر اندامزايي پپروميا27
3-10 اثر سطوح مختلف ساکارز بر اندامزايي پپروميا28
3-11 تاثير سطوح هورموني و تلقيح با باکتري بر رشد ريزنمونه جوانه جانبي درون شيشه28
3- 12 تاثير تلقيح با باکتري بر سازگاري گياهان تکامل يافته در گلدان29
3-13 صفات اندازهگيري شده30
3-13-1 ميانگين تعداد برگ در هر بوته30
3-13- 2 ارتفاع ساقه30
3-13-3 تعداد ريشه در هر بوته30
3-13-4 طول کل ريشه30
3-13-5 تعداد جوانه جانبي30
3-13-6 توسعه برگي30
3-13-7 وزن تر بوته31
3-13-8 وزن خشک بوته31
3-14 تجزيه آماري31
فصل چهارم: نتايج و بحث32
4-1 مقدمه32
4-2 بررسي اثر استفاده از تيمارهاي مختلف گندزدايي در جلوگيري از آلودگي در کشت بافت گياه پپروميا32
4- 3 بررسي تاثير افزايش غلظت فسفر بر اندامزايي پپروميا33
4-4 اثر سطوح مختلف ساکارز بر اندامزايي پپروميا34
4-5 تاثير سطوح هورموني و تلقيح با باکتري بر رشد ريزنمونه جوانه جانبي درون شيشه (2 هفته بعد از كشت)34
4-5-1 تعداد برگ35
4-5-2 طول ساقه باززا شده36
4-5-3 تعداد ريشه باززا شده37
4-5-4 کل طول ريشه باززا شده37
4-5-5 ميانگين طول ريشه38
4-5-6 تعداد جوانه رشد كرده39
4-5-7 توسعه برگي39
4-6 تاثير سطوح هورموني و تلقيح با باکتري بر رشد ريزنمونه جوانه جانبي درون شيشه (چهار هفته بعد از كشت)41
4-6-1 تعداد برگ41
4-6-2 طول ساقه42
4-6-3 تعداد ريشه43
4-6-4 کل طول ريشه باززا شده44
4-6-5 ميانگين طول ريشه46
4-6-6 تعداد جوانه رشد كرده47
4-6-7 توسعه برگي47
4-7 تاثير سطوح هورموني و تلقيح با باکتري بر رشد گياهچههاي کشت بافتي پپروميا در مرحله سازگاري47
4-7-1 تعداد برگ48
4-7-2 طول ساقه49
4-7-3 تعداد ريشه49
4-7-4 کل طول ريشه49
4-7-5 ميانگين طول ريشه50
4-7-6 توسعه برگي50
4-7-7 وزن تر بوته51
4-7-8 وزن خشک بوته52
4-8 اندامزايي مستقيم در گياه پپروميا53
فصل پنجم: نتيجه گيري54
5-1 بحث54
5-2 نتايج56
5-3 پيشنهادات57
منابع58
فهرست جداول:
عنوان صفحه
جدول 3-1 مقادير قند به کار رفته در محيط کشت …………………………………………………………………………………. 30
جدول 4-1 نتايج تجزيه واريانس اثر تيمارهاي مختلف ضدعفوني در جلوگيري از آلودگي ريزنمونه در کشت بافت پپروميا………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 35
جدول 4-2 خلاصه تجزيه واريانس اثر سطوح مختلف هورمون و باکتري بر صفات مربوط به رشد درون شيشه اي ريزنمونه جوانه جانبي پپروميا ………………………………………………………………………………………………………………..38
جدول 4-3 خلاصه تجزيه واريانس اثر سطوح مختلف هورمون و باکتري بر صفات مربوط به رشد درون شيشه اي ريزنمونه جوانه جانبي گياه پپروميا (تاريخ دوم)…………………………………………………………………………………………44
جدول 4-4 خلاصه تجزيه واريانس سطوح مختلف هورمون و باکتري بر صفات مربوط به رشد گياهچههاي کشت بافتي پپروميا در مرحله سازگاري……………………………………………………………………………………………………………………..51
فهرست نمودارها:
عنوان نمودار صفحه
نمودار4-1 درصد بروز آلودگي ريزنمونه تحت تيمارهاي مختلف ضدعفوني در کشت بافت گياه پپروميا …. 36
نمودار 4-2 اثر تيمار باکتري بر تعداد برگ گياه پپروميا درون شيشه……………………………………………………… 39
نمودار 4-3 اثر تيمار باکتري بر طول ساقه باززا شده گياه پپروميا …………………………………………………………. 40
نمودار 4-4 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتري بر كل طول ريشه در گياه پپروميا درون …………………………. 41
نمودار 4-5 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتري بر ميانگين طول ريشه در گياه پپروميا درون شيشه…………… 42
نمودار 4-6 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتري بر تعداد برگ گياه پپروميا درون شيشه (تاريخ دوم)………….. 45
نمودار 4-7 اثر سطوح هورمون بر طول ساقه باززا شده گياه پپروميا (تاريخ دوم) …………………………………… 46
نمودار 4- 8 اثر سطوح هورمون بر تعداد ريشه باززا شده گياه پپروميا (تاريخ دوم) ………………………………… 47
نمودار 4-9 اثر تيمار باكتري بر تعداد ريشه باززا شده گياه پپروميا (تاريخ ……………………………………………….47
نمودار 4- 10 اثر سطوح هورمون بر كل طول ريشه باززا شده گياه پپروميا (تاريخ ………………………………… 48
نمودار 4- 11 اثر تيمار باكتري بر كل طول ريشه باززا شده گياه پپروميا (تاريخ دوم)……………………………….. 49
نمودار 4- 12 اثر سطوح هورمون بر ميانگين طول ريشه باززا شده گياه پپروميا (تاريخ دوم)…………………….. 50
نمودار 4- 13 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتري بر تعداد برگ گياه پپروميا در مرحله سازگاري ……………… 52
نمودار 4 -14 اثر سطوح هورمون بر طول كل ريشه گياه پپروميا در مرحله سازگاري……………………………….. 53
نمودار 4- 15 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتري بر توسعه برگ گياه پپروميا در مرحله سازگاري ……………. 54
نمودار 4- 16 اثر تيمار باکتري بر وزن تر گياه پپروميا در مرحله سازگاري……………………………………………… 55
نمودار 4- 17 اثرمتقابل سطوح هورمون و باکتري بر وزن خشك گياه پپروميا در مرحله سازگاري ……………. 56
فهرست شکلها:
عنوان شکل صفحه
شکل 1-1 گياه پپروميا (برگ قاشقي) …………………………………………………………………………………….. 5
شکل 3-1 قرار دادن باکتريها بر روي شيکر جهت تهيه مايع تلقيح …………………………………………. 25
شکل 3-2 ساخت محيط کشت و تنظيم pH محيط کشت ……………………………………………………… 26
شکل 3-3 انجام آبشويي قبل از استفاده از مواد شيميايي براي ضدعفوني …………………………………… 27
شکل 3-4 شيشههاي حاوي ريز نمونه پپروميا ………………………………………………………………………. 27
شکل 3-5 نگهداري ريز نمونهها در شرايط مطلوب ايجاد شده در اتاق رشد …………………………….. 28
شکل 3-6 گياهچههاي پپرومياي کشت بافتي منتقل شده به گلدان ……………………………………………. 32
شکل 4-1ريزنمونه كشت شده در آزمايش فسفات …………………………………………………………………. 37
شکل 4-2 ريشههاي ايجاد شده بر روي ريزنمونه برگي گياه پپروميا …………………………………………. 38
شکل 4-3 ريزنمونه ريشهدار شده پپروميا در محيط تلقيح شده با باکتري …………………………………… 43
شکل 4-4 ريزنمونه پپروميا تلقيح شده با تيمار باکتريايي محرک رشد ……………………………………….. 43
شکل 4-6 اندامزايي مستقيم قطعات برگي گياه پپروميا (ريشهزايي) …………………………………………… 60

جدول علائم و اختصارها:

معادل فارسيمعادل انگليسيعلامتام اسMurashic and SkogeMSآي اي ايIndol Acetic Acid IAAاي بي ايAbscisic AcidABAان اي ايNaftalin Acetic AcidNAAآي بي ايIndol Butyric AcidIBAپي جي پي آرPlant Growth Promoting RhizobacteriaPGP

چکيده:
باکتريهاي محرک رشد گياهي به عنوان يکي از راههاي افزايش رشد گياه شناخته ميشوند. امکان استفاده از اين موجودات در تحقيقات آزمايشگاهي گياهي از جمله کشت بافت گياهي هنوز در حال بررسي است. با توجه به اينکه اين ميکروارگانيزمها انواع مواد (از جمله اكسين، سيتوكينين، جيبرلين و سيدروفورها) را به محيط اضافه ميکنند، احتمال اينکه بر روي مراحل مختلف کشت بافت از ايجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتي داشته باشند وجود دارد. هدف از اين تحقيق بررسي اثرات دو باکتري محرک رشد گياهي بر روي تکثير گياه پپروميا از طريق کشت بافت بود. آزمايش به صورت طرح فاکتوريل در قالب طرح پايه کاملا تصادفي با سه تکرار اجرا شد. فاکتور باکتري محرک رشد شامل سطوح: 0: شاهد (بدون باکتري)، 2: Azospirillum lipoferrum، 3:Pseudomonas fluorescent و فاکتور هورمون شامل: 0: بدون هورمون، 1: سطح هورمون برابر با 5/1 ميليگرم در ليتر IAA و 1 ميليگرم در ليتر 2IP و 2: مقدار هورمون دو برابر غلظت قبلي بودند. قبل از کشت مقدار 08/0 ميلي ليتر از کشت مايع باكتريها، بر روي محيط کشت تلقيح شد و سپس جوانههاي پپروميا در محيطهاي مذکور کشت شدند. بعد از گذشت 4 هفته از کشت، جوانههاي کشت شده گياه پپروميا به اندازه کافي رشد کرده و قابل انتقال به خاک شدند. قبل از انتقال گياهچههاي جوان به گلدان و بعد از طي کردن مراحل سازگاري اندازهگيري صفات مورد نظر انجام شد. نتايج نشان داد در آزمايش درون شيشهاي اثر متقابل هورمون و باکتري بر کل طول ريشه و ميانگين طول ريشه معنيدار بود. تيمارAzospirillum بدون هورمون داراي بيشترين طول ريشه بود و اختلاف معني دار با ديگر تيمارها داشت. اثر اصلي باکتري بر طول ساقه و تعداد برگ معنيدار بود. مشاهده شد تلقيح ريزنمونهها با هر دو باکتري نسبت به شاهد باعث افزايش معنيدار طول متوسط شاخههاي باززا شده گرديد. افزايش طول ساقه در تيمارهاي باکتري نسبت به شاهد در حدود 5/1 برابر بود. در مرحله سازگاري، اثرمتقابل هورمون و باکتري بر تعداد برگ، توسعه برگي و وزن خشک و اثر باکتري بر وزن تر و اثر هورمون بر کل طول ريشه و وزن خشک معنيدار بود. در کل تلقيح با باکتري تاثيرات مثبتي بر تعداد برگ، توسعه برگي، طول شاخه و طول ريشه داشت. ولي تاثير منفي تلقيح باکتري بر وزن تر و خشک مشاهده گرديد. افزايش سطح هورمون تاثير مثبت بر طول کل طول ريشه داشت.

کلمات کليدي: کشت بافت،lipoferrum Azospirillum، Pseudomonas fluorescent، فيتوهورمون، پپروميا.

فصل اول
کليات تحقيق

1-1 گياهشناسي پپروميا
گياه پپروميا (برگ قاشقي) از جنسPeperomia و خانواده Piperaceae ميباشد. اين جنس داراي بيش از ???? گونه مختلف از گياهان هميشهسبز بالارونده است که اغلب آنها برگهاي زيبايي دارند. گونه مذکور بومي نواحي استوايي آمريکا بوده و گياهي است بسيار کم رشد که ارتفاع آن به حدود ? تا ?? سانتيمتر ميرسد. برگهاي آن بسيار زياد و قلبي شکل ميباشند که از قسمت مرکزي گياه خارج ميشوند. برگهاي پپروميا صورتي کمرنگ ميباشد. گلها به رنگ سفيد و به شکل گل آذين سنبله مانند و به طول ?? تا ?? سانتيمتر هستند و از اوايل بهار تا اواخر پاييز به چشم ميخورند. اين گياه به نور متوسط، حرارت زياد، خاک هميشه مرطوب، رطوبت ?? تا ?? درصد و خاک قليايي احتياج دارد. کود مورد نياز اين گياه را مي‌توان به ميزان ? گرم در ليتر، هر دو هفته يکبار از فروردين تا مهرماه، مورد استفاده قرار داد (کريمي، 1390).

1-2 نگهداري گياه پپروميا
پپروميا گياهي است گرمسيري با برگهاي چرمي شکل و قاشقي (شکل1-1)، اين گياه داراي نياز آبي کم (بسته به شرايط محيط) ميباشد، و همچنين نياز نوري کمي دارد و سايه آپارتمان را به خوبي تحمل ميکند، هم بصورت مجزا و هم در کاشت گروهي زيباست. اين گياه اگرچه رشد سريعي ندارد، ولي در هر شرايطي در آپارتمان پرورش مييابد. معمولا آنها را در تراريوم و باغ شيشهاي يا مجموعهي گلهاي يک سبد پرورش ميدهند. با توجه به شکل ظاهري و نحوهي رشد آنها را به سه گروه تقسيم نمودهاند: گروه اول: بوتهاي که داراي دمبرگهاي قرمز هستند، بعضي نيز برگهاي گوشتي و قلبي شکل دارند، گروه دوم: داراي ساقههاي بلند و قرمز رنگ هستند و بعضي ساقههاي گوشتي دارند و لبه برگها ارغواني است و گاه سطح برگ با موهاي بسيار ظريفي پوشيده شده است. گروه سوم: گروه بالارونده که به داربست يا قيم بسته ميشوند و بالا ميروند، با اينکه از گلدان آويزان ميشوند و داراي ساقههاي قرمز و بسيار ظريف نقرهاي و بعضي داراي برگهاي سبز آبدار هستند و بخصوص براي گلدانهاي آويز بسيار مناسبند. گياه پپروميا يک ساقه گلدهنده با شاتونهاي سبز رنگ توليد ميکند که ارزش زينتي ندارد، زماني که اين گياه به گل ميرود، کيفيت برگها و زيبايي آن کمتر ميشود، با حذف ساقههاي گلدهنده ميتوان گياه را مرتب به حالت رويشي و نونهالي مشاهده کرد. اين گياه به سرماي زياد مقاومت ندارد و حداکثر ميتواند در زمستان 15 درجه سانتيگراد را تحمل نمايد و در فصل رشد دماي 24 تا 30 درجه براي آن بسيار مناسب است. اين گياه در زير تابش اشعه فلورسنت پژمرده ميشود و نياز چنداني به آب ندارد و هميشه مقدار زيادي آب در برگهاي آن وجود دارد و سطح خاک گلدان بين دو آبياري بايد کاملا خشک شود، ولي نبايد آبياري آنقدر به تعويق افتد که برگها پژمرده شوند. در زمستان به آب ولرم نياز دارد و مقدار آبياري بايد بسيار کمتر باشد، ريشه آن سطحي است و گسترش چنداني ندارد و در هواي آلوده، زرد و خشک ميشود، در صورت آب دادن زياد اطراف يقه ساقه، موجب پوسيدگي اطراف آن ميشود. ميزان رطوبت هواي لازم براي اين گياه حدود 50 درصد است، چنانچه رطوبت و حرارت و سرما از حد خود تجاوز کند، لکههايي بر سطح برگ ظاهر ميشوند، برگ را بيحس ميکنند و ميافتد. هر دوماه يکبار سطح خاک گلدان را بايد خراش داد تا هوا به داخل آن نفوذ کند و در فصل بهار گلدان را در فضاي آزاد در محلي سايه قرار دهيد تا حالت طبيعي خود را به دست آورد. هر اندازه قابليت نفوذ خاک اين گياه بيشتر باشد ريشه و ساقه از پوسيدگي محفوظ خواهد بود. بهتر است براي تهيه خاک گلدان اين گياه يک قسمت پيت بعلاوه يک قسمت ماسه به همراه يک قسمت خاک باغچه استفاده شود و کف گلدان مقداري ماسه و سنگريزه بريزيد، زمان مناسب براي تغيير گلدان اين گياه فصل بهار است. پپرومياي ابلق يا سفيد با قلمههاي بذر و ساقه تکثير ميشود و پپرومياي سبز با قلمههاي برگ و ساقه تکثير ميشود. بهتر است در بهار و تابستان از قلمههاي يک ساله براي گياه استفاده نمود و براي اين کار قلمه را به ميزان 4 تا 5 سانتيمتر در ماسه شسته فرو برده و در محلي که دماي آن 18 درجه باشد در تاريکي قرار ميدهند. در مورد انواع گوشتي آن برگ را روي سطح ماسه خوابانيده و روي آن ماسه شسته ميريزند، پس از مدتي در انتهاي رگبرگها ريشه ظاهر ميشود (کريمي، 1390).

1-3 نقش کشت بافت در تکثير گياهان
تكنيك كشت بافت گياهي نقش كليدي در انقلاب سبز دوم دارد كه در اين انقلاب تغييرات ژني و بيوتكنولوژي جهت پيشرفت كيفيت و كميت محصولات زراعي بكار ميروند. اين تكنولوژي براي محدوده وسيعي از گياهان زراعي و گونههاي درختي جهت حل مشكلات بكار گرفته شده است. اين روش بواسطه تلاشهاي مداوم و پيگير تعداد زيادي از دانشمندان كه كارهاي پايهاي انجام دادهاند، ممكن شده است. كشت بافت گياهي اصطلاحي است كه بطور كلي براي رشد درون شيشهاي و عاري از بيماري گياه بر روي محيط مغذي بكار ميرود. اين تكنولوژي بر سه اصل اساسي استوار است (باقري و همکاران، 1381):
* قسمتي كه بايد از گياه اصلي جدا شود.
* ريزنمونه بايد در شرايط شيميايي (محيط كشت) و فيزيكي (محيطي) تعريف شده نگهداري شود.
* شرايط استريل و عاري از آلودگي بايد حفظ شود

شکل 1-1 گياه پپروميا (برگ قاشقي)

دانش امروزي اجازه بكارگيري هر قسمت از گياه را براي شروع كشت ميدهد. قسمتي از گياه كه براي اين منظور بكار ميرود ريزنمونه ناميده ميشود. انتخاب هر قسمت از گياه با توجه به هدف از كشت متفاوت است. مواد و نمونههايي كه از محيط خارج جمعآوري و به آزمايشگاه آورده ميشوند، در حين انتقال، بهتر است در شرايط مناسب نگهداري شوند تا فعاليتهاي كاتابوليكي به حداقل برسد. مواد بطور كامل بايد با آب جاري و مايع شوينده شستشو داده شوند (مانند تويين-801)، بعد از شستشو و حذف ذرات چسبنده بسته به نوع ريزنمونه مراحل استريل انجام شده و سپس كشت انجام ميشود. کشت بافت گياهي يا کشت درون شيشهاي عبارت است از رشد سلول، بافت و يا اندام گياهي در يک محيط غذايي مصنوعي استريل که به صورت جامد يا مايع تهيه ميشود، اين روش به عنوان يکي از شاخههاي زيستفناوري، کاربرد گستردهاي در کشاورزي دارد. در کشت بافت، قسمتي از گياه به نام قلمه يا ريزنمونه که ممکن است بخشي از ساقه، برگ، جوانه و يا يک سلول باشد، در محيط کنترل شده کشت ميشود. در اين نوع کشت، شرايط به گونهاي است که عاري از هرگونه ميکروارگانيسم بوده و رژيم متعادلي از مواد شيميايي و آلي مورد نياز رشد گياه فراهم است. در واقع در کشت درون شيشهاي محيط کشت بستري براي رشد گياه است و ترکيبي از مواد شيميايي و آلي در يک ژل مغذي يا محيط مايع براي رشد سلولها و بافتها ميباشد (شريفي و همکاران، 1389).
در سال 1838 شوان و شيلدن2 نظري? توتيپوتنسي3 را ارائه نمودند. براساس اين نظريه، هر سلول گياهي، هنگامي که در محيط غذايي مصنوعي و شرايط مناسب کشت شود، ميتواند به گياهي جديد و کامل تبديل شود. بعدها دانشمند آلماني، هابرلند4 (1902) براي اولين بار به بررسي اين نظريه پرداخت و ادعا کرد که اگر محيط و تغذيه سلولهاي کشت شده مناسب باشند، سلولهاي کشت شده ميتوانند، گياهان نرمالي را بوجود آورند. اما تلاشهاي او در انجام کشت بافت ناموفق بود. او همچنين معتقد بود که قطعه قطعه کردن نامحدود بافتهاي گياهي بر روي قدرت تکثير سلولها تأثير نميگذارد. او استفاده از مايع موجود در کيسه جنيني و توليد جنينهاي مصنوعي را از سلولهاي رويشي پيشنهاد کرد (احمديان، 1380). به دليل تاخير در کشف هورمونهاي گياهي، کشت بافت گياهي پس از کشت بافت حيواني و انساني شروع شد. اولين کشت موفقيتآميز بافتهاي گياهي، توسط وايت5 در سال 1934 انجام شد. او در سال 1939 اولين کشت موفقيتآميز کالوس هويج و توتون را گزارش کرد. اولين هورمون تنظيمکننده رشد که کشف شد، اکسين بود که موفقيت بزرگي را براي کشت بافت در شرايط درون شيشهاي به همراه داشت. بعد از کشف تنظيمکننده رشد کينتين در سال 1955، انگيزه بيشتري براي کشت بافت حاصل شد. بزرگترين مشوق براي استفاده از فنون کشت بافت گياهي براي تکثير بسياري از گونهها، ممکن است کار اوليه مورل6 روي تکثير ارکيده و کار موراشيگ و اسکوگ7 در 1964 در ايجاد محيط کشت جديدي با غلظت بالاي نمکهاي معدني بوده باشد (احمديان، 1380).

1-4 ترکيبات محيطهاي کشت
محيط کشت يکي از مهمترين اجزاء کشت ياخته و بافت گياهي است. کاربرد موفق فنون کشت بافت گياهي به ميزان زيادي به محيط کشتي با ترکيب صحيح بستگي دارد. ترکيب محيطهاي کشت به روش خاص کشت به کار رفته تغيير مييابد. براي نمونه روشهايي مانند باززايي گياهان کامل از ياختهها يا بافتها نيازمند محيطهاي کشتي با ترکيبات مختلف براي آغازش هريک از مراحل توالي تکويني است. علاوه بر ترکيب آن، نقش مهم ديگر محيط کشت فراهم کردن محيط فيزيکي مناسب براي ياختهها و بافتها براي رشد ميباشد. براي نمونه محيطهاي کشت جامد، نقشي شبيه خاک را از طريق فراهم کردن يک زمينه و حامل فيزيکي که ريزنمونههاي بافت بتوانند تماس با هوا را براي تبادل گاز حفظ نمايند يا جايي که گياهچههاي باززايي شده بتوانند ريشه دهند، ايفا ميکنند. از سوي ديگر، کشتهاي تعليقي در حال رشد در کشت مايع در حال تکان خوردن، ياختهها را قادر ميسازد تا حداکثر تماس را با اجزاي محيط کشت حفظ کنند و تبادل گازها تسهيل شود. تمام ياختههاي گياهي زنده براي حفظ و رشد و نمو نيازمند آب، عناصر غذايي (عناصر معدني و ترکيبات آلي) و تنظيمکنندههاي رشد گياهي (هورمونها) هستند. ترکيبات محيطهاي کشت بافت گياهي معمولا اين نيازمنديها را منعکس ميسازند و چندين ترکيب اختصاصي (مانند محيط کشت موراشيک و اسکوگ يا محيط ام. اس) که به طور رايج براي کشت به کار ميروند داراي ترکيبات پايه مشابهي هستند. مواد مورد نياز براي کشت ياخته گياهي را ميتوان به سه گروه تقسيم کرد که عبارتند از: عناصر غذايي معدني، عناصر غذايي آلي و تنظيمکنندههاي رشد گياهي (باقري و همکاران، 1383؛ شريفي و همکاران، 1389).

1- 4 – 1 مواد غير آلي
عناصر غذايي غير آلي، عناصر معدني هستند و معمولا بر اساس غلظتهاي ضروري به دو گروه تقسيم ميشوند: عناصر پرمصرف که در مقادير زياد (غلظتهاي ميليمول) و عناصر کممصرف که تنها در غلظتهاي بسيار پايين (ميکرومول) ضروري ميباشند. عناصر پرمصرف شامل: نيتروژن، گوگرد، فسفر، کلسيم، منيزيم، پتاسيم و عناصر کممصرف شامل: آهن، بر، کبالت، مس، يد، منگنز، موليبدن و روي هستند. عناصر غذايي آلي در حالي که گياهان سبز خودپرور هستند، ولي بيشتر سيستمهاي کشت حداقل در مراحل اوليه، خودناپرور ميباشند و به يک منبع آلي کربن و انرژي نيازمند هستند. کشتها براي آغاز توسعه کلروپلاستها و فتوسنتز اغلب در روشنايي پرورش داده ميشوند. علاوه بر يک منبع آلي از کربن و انرژي، کشتهاي گياهي ممکن است به مولکولهاي آلي پيچيده براي رشد سالم نيز نيازمند ميباشند (خسروشاهلي و همکاران، 1386).

1- 4- 2 منبع کربن
قندها براي تامين کربن و انرژي به محيطهاي کشت گياهي افزوده ميشوند. ساکارز متداولترين قند مورد استفاده در محيطهاي کشت گياهي است، ولي گلوکز، فروکتوز و سوربيتول در برخي از محيطهاي کشت مورد استفاده قرار ميگيرند. علاوه بر نقش متابوليکي آن، ساکارز همچنين به عنوان يک اسمزنگهدار عمل ميکند و همراه با عناصر غذايي معدني به تعادل پتانسيل اسمزي محيط کشت کمک ميکند (شريفي و همکاران، 1389).

1 – 4 – 3 ويتامينها
ويتامينهاي افزوده شده، براي کشتهاي ياخته و بافت گياهي ضروري نيستند، هرچند ويتامين B1 (تيامين) براي کشتهاي برخي از گونهها سودمند تشخيص داده شده است. با وجود اين بيوتين، اسيدپانتوتنيک، اسيدنيکوتينيک (نياسين)، پيريدوکسين (پيريدوکسول، ويتامين B6)، اسيدفوليک، اسيداسکوربيک (ويتامين C) و توکوفرول (ويتامين E) به برخي از محيطهاي کشت افزوده ميشود. افزودن انفرادي عصاره مخمر8 گاهي اوقات به عنوان منبع ويتامينها صورت ميگيرد. الکل قند ميواينوزيتول به وفور در محيطهاي کشت براي گياهان تک لپهاي، بازدانگان و برخي از گياهان دولپهاي به کار ميرود. اين الکل قندي نقشي را در توسعه ديواده ياخته و غشاء ايفا ميکند (باقري و همكاران، 1383).

1 – 4 – 4 آمينواسيدها و مکملهاي آلي
آمينواسيدها هنگام كاهش نيتروژن نقش خود را ايفا ميكنند. در صورت ناكافي بودن نيتروژن، مكمل نيتروژن آلي كمپلكس مانند كازئينهيدروليزات (1-1/0 گرم بر ليتر) ممكن است افزوده شود. گلايسين آمينواسيدي است كه عموما استفاده ميشود. ساير مكملهاي آلي عبارتند از شير نارگيل، عصاره مخمر، پپتون و عصاره جو، هرچند محيطهاي كشت مصنوعي ترجيح داده ميشوند و مكملهاي آلي كه طبيعت شيميايي ناشناخته دارند فقط در مواقع ضروري بكار ميروند (ابراهيم زاده و همکاران، 1384).

1 – 4- 5 تنظيمکنندههاي رشد گياهي
پنج گروه اصلي از تنظيمکنندههاي رشد گياهي يا هورمونهايگياهي وجود دارد که رشد و تمايزيابي در گياه را هماهنگ ميکنند و عبارتند از: اکسينها، سايتوکينينها، جيبرلينها، اسيدآبسزيک و اتيلن. اتيلن به طور عمده در ريزش، پيري گل و رسيدن ميوه موثر است و به ندرت در کشتهاي بافت گياهي به کار ميرود. از چهار گروه ديگر هورمونهاي گياهي، اکسينها و سايتوکينينها به وفور در کشتهاي بافت گياهي به کار ميروند و جيبرلينها و اسيد آبسزيک گهگاه مورد استفاده قرار ميگيرند (خسروشاهلي و همکاران، 1386).

1 – 4 – 6 عامل ژلهايکننده
براي کشت بافت نياز به يک عامل جامدکننده محيطي است تا نمونه به راحتي روي آن قرار گيرد و از غوطهور شدن آن جلوگيري به عمل آيد (جورج و همکاران، 1987).

1- 4 – 6 – 1 آگار
آگار متداولترين ژل مورد استفاده در کشت بافت گياهي است. آگار، پليساکاريد پيچيدهاي است که از جلبک قرمز استخراج شده است و از دو بخش آگارز (70 درصد) و آگاروپکتين (30 درصد) تشکيل شده است. آگارز بخش ژلساز بوده و شامل پليمري از واحدهاي مونوساکاريد متناوب د-گالاکتوز و 3،6- آنيدروگالاکتوز است. آگار در دماي حدود 100 درجه سانتيگراد ذوب ميشود و در دماي حدود 35 درجه سانتيگراد به حالت ژل در ميآيد. آگار پايدار است، با اجزاي محيطهاي کشت واکنش نميدهد و به طور طبيعي توسط آنزيمهاي گياهي هضم نميشود (ابراهيم زاده و همکاران، 1384).

1-5 ظروف کشت
نوع ظروف استفاده شده در کشت بافت اثرات قابل توجهي بر سرعت رشد کشتها، کيفيت ساقهها و گياهچههاي توليد شده و درجه ي شيشهاي شدن دارد. در اين مورد بويژه حجم ظرف، رطوبت هوا در فضاي بالاي کشت درون ظرف و ميزان تبادل گازي با هواي بيرون ظرف اهميت خاصي دارد (مک کون و سلمر9، 1987).

1 – 6 انتخاب و تهيه ريزنمونه
زماني که گياه دهنده ريزنمونه در گلخانه يا اتاقک رشد پرورش مييابند، گياهان در تمام طول سال در مرحله مناسبي از رشد ميتوانند در دسترس باشند. اما ريزنمونههاي حاصل از درختان فقط زماني براي ريزازديادي در شرايط مطلوب هستند که به موقع جمعآوري شوند. نگهداري مواد گياهي جمعآوري شده در زمان مناسب، طول دورهاي را که از آن ميتوان استفاده نمود افزايش ميدهد (احمديان، 1380).

1 – 7 ريزازديادي
سه نوع اصلي ريزازديادي عبارتاند از: 1- رشد طولي ساقه جانبي (پرآوري) 2- اندامزايي 3- جنينزايي
رشد طولي ساقه جانبي زماني انجام ميشود که جوانههاي جانبي که بطور معمول غيرفعالاند، از غالبيت انتهايي رهايي يابند. اين کار بيشتر از طريق تغيير هورمونها (اساساً سايتوکينينها) در محيط کشت غذايي اعمال ميشود. براي رشد طولي ساقه جانبي، فراوانترين نوع ريزنمونه قطعات کوچک ساقه يا تک گره است. ميزان تشکيل ساقه جانبي گاهي اوقات پس از چند واکشت افزايش مييابد (خسروشاهلي و همکاران، 1386).
در اندامزايي ساقههاي نابجايي القاء ميشوند که سپس ريشهدار ميگردند. در اين حالت به ندرت ريشهها قبل از ساقه ايجاد ميشوند. در جنينزايي، جنينهاي سوماتيکي از رشد يک سلول ايجاد شده و پس از بلوغ به يک گياه کامل تبديل ميشوند.

1-8 کودهاي زيستي
مسئله استفاده بيرويه و نادرست از سموم و کودهاي شيميايي بسيار جدي و از چند جنبه قابل بررسي است. از مهمترين آن آسيب زيست محيطي و بهداشتي است. جنبه ديگر نيز بُعد اقتصادي آن است. بقايا و آثار ترکيبات کود شيميايي در محيط آب و خاك موجب برهم خوردن تعادل اکوسيستمها ميشود. اين معايب کودهاي شيميايي و هزينه بالاي توليد آنها باعث شد که توليد کودهاي زيستي مورد توجه جدي قرار گيرد. در نظامهاي کشاورزي پايدار کاربرد کودهاي زيستي از اهميت ويژهاي در افزايش باروري و حفظ حاصلخيزي پايدار خاك برخوردار است. امروزه استفاده از ظرفيتهاي طبيعي ارگانيسمهاي مفيد خاکزي با هدف بهرهگيري از توانايي و پتانسيل آنها به منظور توليد حداکثر محصول مورد توجه قرار گرفته است (وسي، 2003).
دامنه ميکروارگانيسمهاي خاکزي مورد استفاده در توليد کودهاي زيستي در طول قرن بيستم توسعه بسياري يافته است و امروزه طيف وسيعي از باکتريهاي خاکزي (انواع ريزوبيوم، سودوموناس، ازتوباکتر، آزوسپريلوم، باسيلوس و غيره)، قارچها (انواع قارچهاي ميکوريزي و اندوفيتي) و جلبکها با مکانيسمهاي مختلف براي توليد کودهاي زيستي استفاده ميشوند. با اين حال هنوز هم باکتريها فراوانترين انواع در توليد کودهاي زيستي محسوب ميشوند. امروزه کودهاي زيستي در فرمولاسيونهاي متفاوت براي محصولات مختلف کشاورزي از قبيل غلات، سبزي و صيفي، گياهان صنعتي، باغات و گلخانهها استفاده ميشوند (اسدي رحماني، 1389). اهميت استفاده از PGPRها براي گياهان مختلف به عنوان کود زيستي هر روزه در حال افزايش ميباشد و تحقيقات وسيعي در اين مورد در حال اجراست. اما امکان استفاده از اين موجودات در تحقيقات آزمايشگاهي گياهي از جمله کشت بافت گياهي هنوز در حال بررسي است. با توجه به اينکه اين ميکروارگانيزمها انواع مواد را به محيط اضافه ميکنند، احتمال اينکه بر روي مراحل مختلف کشت بافت از ايجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتي داشته باشند وجود دارد. در اين مورد گزارشهاي بسيار اندکي موجود است و تحقيق بر روي اين موضوع ضروري به نظر ميرسد (احمدزاده، 1392).

1-9 باکتريهاي محرک رشد گياه (PGPRsها10)
باکتريهاي ريزوسفري محرك رشد گياه (PGPR) به گروه نامتجانسي از ميكروارگانيزمها اطلاق ميشوند كه سبب افزايش رشد گياه ميشوند (وسي11، 2003). جنسهاي متعددي از باكتريها به عنوان انواع محرك رشد گياه معرفي شدهاند. اين باکتريها در بسياري از فرايندهاي كليدي بوم نظام از جمله كنترل بيولوژيكي پاتوژنهاي گياهي، چرخه عناصر غذايي و استقرار گياهچه دخالت دارند و امروزه براي اهداف كشاورزي و جنگلداري مورد توجه ميباشند. اين باكتريها ممكن است ريزوسفر، سطح ريشه و يا حتي فضاي بين سلولي را كلونيزه نمايند (مک کلي12، 2001). باكتريهاي ريزوسفري محرك رشد گياه ميتوانند با استفاده از مكانيزمهاي مختلفي به طور مستقيم و غيرمستقيم در افزايش رشد و عملكرد گياه نقش داشتهاند. در روش غيرمستقيم باكتريهاي محرك رشد با استفاده از مكانيزمهاي خاصي اثرات مضر بيماريهاي گياهي را تعديل نموده و به اين طريق موجب افزايش رشد گياه ميشوند. در روش مستقيم اين باكتريها با تثبيت آزادزي نيتروژن، توليد متابوليتهاي موثر در رشد گياه، مانند هورمونهاي گياهي (اكسين، سيتوكينين، جيبرلين)، انواع ويتامينها بخصوص ويتامينهاي گروه B و انواع اسيدهاي آمينه مثل آرژنين، ليزين، تريپتوفان و بيوتين، افزايش حلاليت تركيبات نامحلول مثل فسفر و پتاسيم از طريق توليد اسيدهاي معدني و آلي، توليد سيدروفورها و افزايش فراهمي عناصر كم مصرف به ويژه آهن و توليد آنزيم ACC دآميناز موثر در كاهش اثرات سوء اتيلن تنشي به رشد بهتر گياه كمك ميكنند (گليک و همکاران13، 2001).
باكتريهاي ريزوسفري محرك رشد گياه ميتوانند با استفاده از مكانيزمهاي مختلفي به طور مستقيم و غيرمستقيم در افزايش رشد و عملكرد گياه نقش داشته باشند. در روش غيرمستقيم باكتريهاي محرك رشد با استفاده از مكانيزمهاي خاصي اثرات مضر بيماريهاي گياهي را تعديل نموده و به اين طريق موجب افزايش رشد گياه ميشوند. در روش مستقيم اين باكتريها با تثبيت آزادزي نيتروژن، توليد متابوليتهاي موثر در رشد گياه، مانند هورمونهاي گياهي (اكسين، سيتوكينين، جيبرلين)، انواع ويتامينها بخصوص ويتامينهاي گروه B و انواع اسيدهاي آمينه مثل آرژنين، ليزين، تريپتوفان و بيوتين، افزايش حلاليت تركيبات نامحلول مثل فسفر و پتاسيم از طريق توليد اسيدهاي معدني و آلي، توليد سيدروفورها و افزايش فراهمي عناصر كم مصرف به ويژه آهن و توليد آنزيم ACC دآميناز موثر در كاهش اثرات سوء اتيلن تنشي به رشد بهتر گياه كمك ميكنند (گليک و همکاران14، 2001).
باكتريهاي آزادزي خاك كه براي گياهان مفيد هستند، اغلب شامل تعدادي از باكتريهاي مختلف نظير Azotobacter،Azospirillum ،Pseudomonads ، Acetobacter،Burkholderia ، Bacilli و غيره هستند. باكتريهايPGPR ميتوانند روي رشد و نمو گياه به دو طريق غير مستقيم و يا مستقيم تاثير داشته باشند. تحريك غيرمستقيم رشد گياه موقعي رخ ميدهد كه باكتريها، برخي از اثرات مضر يك موجود بيماريزا را توسط يك يا چند مكانيسم كاهش داده يا از عمل آن جلوگيري به عمل آورند. به عبارت ديگر، تحريك مستقيم رشد گياه توسطPGPR معمولاً شامل تامين گياه با يك تركيب سنتز شده توسط باكتري يا تسهيل جذب عناصر غذايي از محيط ميباشد. چون بسياري از تركيبات شيميايي كه جهت جلوگيري از آفات و بيماريها در گياهان استفاده ميشوند براي حيوانات و انسان خطرناك هستند و ميتوانند در اكوسيستمهاي طبيعي ماندگار شده و تجمع پيدا كنند، بنابراين مواد شيميايي در حال جايگزين شدن با روشهاي بيولوژيكي (استفاده از PGPR بيوكنترل) بيخطر براي محيط زيست جهت تحريك رشد گياه هستند (وسي، 2003). خصوصيات مرتبط با بيوكنترل عوامل بيماريزاي گياهي عبارتند از:
1- سنتز آنتيبيوتيك
2- ترشح سايدروفور (كلاته كننده آهن) جهت به دست آوردن آهن محلول از خاك و تامين آن براي گياه و بنابراين محروم كردن عوامل بيماريزاي قارچي در كسب آهن محلول
3- توليد (باقري و همکاران، 1381)متابوليتهاي با وزن مولكولي كم نظير هيدروژن سيانيد با فعاليت ضدقارچي
4- توليد آنزيمهاي كتيناز، بتا-1،‏3-گلوكاناز، پروتئاز يا ليپاز كه ديواره عدهاي از سلولهاي قارچي را ميتوانند ليز كنند.
5- رقابت با عوامل بيماريزاي گياهي براي عناصر غذايي و محلهاي روي سطح ريشه
6- كاهش توليد اتيلن تنشي (ناشي از حمله عامل بيماريزا در گياهان با آنزيم ACC دآميناز) (وسي، 2003).

1-10 مکانيسم عمل PGPR ها
باكتريهاي ريزوسفري محرك رشد گياه ميتوانند با استفاده از مكانيزمهاي مختلفي به طور مستقيم و غيرمستقيم در افزايش رشد و عملكرد گياه نقش داشتهاند. در روش غيرمستقيم باكتريهاي محرك رشد با استفاده از مكانيزمهاي خاصي اثرات مضر بيماريهاي گياهي را تعديل نموده و به اين طريق موجب افزايش رشد گياه ميشوند. در روش مستقيم اين باكتريها با تثبيت آزادزي نيتروژن، توليد متابوليتهاي موثر در رشد گياه، مانند هورمونهاي گياهي (اكسين، سيتوكينين، جيبرلين)، انواع ويتامينها بخصوص ويتامينهاي گروه B و انواع اسيدهاي آمينه مثل آرژنين، ليزين، تريپتوفان و بيوتين، افزايش حلاليت تركيبات نامحلول مثل فسفر و پتاسيم از طريق توليد اسيدهاي معدني و آلي، توليد سيدروفورها و افزايش فراهمي عناصر كم مصرف به ويژه آهن و توليد آنزيم ACC دآميناز موثر در كاهش اثرات سوء اتيلن تنشي به رشد بهتر گياه كمك ميكنند. اهميت استفاده از PGPR ها براي گياهان مختلف به عنوان کود زيستي هر روزه در حال افزايش ميباشد و تحقيقات وسيعي در اين مورد در حال اجراست. اما امکان استفاده از اين موجودات در تحقيقات آزمايشگاهي گياهي از جمله کشت بافت گياهي هنوز در حال بررسي است. با توجه به اينکه اين ميکروارگانيزمها انواع مواد را به محيط اضافه ميکنند، احتمال اينکه بر روي مراحل مختلف کشت بافت از ايجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتي داشته باشند وجود دارد. در اين مورد گزارشهاي بسيار اندکي موجود است و تحقيق بر روي اين موضوع ضروري به نظر ميرسد. گليک (2001) عوامل پروبيوتيك از نظر عملكرد به دو گروه اصلي تقسيم ميشوند:
1- عواملي كه به‌طور مستقيم با مكانيزم‌هاي مختلف بر رشد گياهان و جوانهزني بذور يا بهبود توليد محصولات تاثير مي‌گذارند.
2- عواملي كه از طريق كنترل بيمارگرهاي گياهي به‌طور غيرمستقيم براي رشد گياهان مفيد هستند.

1-10-1 نقش مستقيم PGPR ها
باكتري‌هاي محرك رشد گياه به‌طورمستقيم از طريق مکانيزمهاي زير سبب رشد بهتر گياهان مي‌شوند (احمدزاده، 1392):
1- تثبيت ازت: 78 درصد اتمسفر را ازت تشكيل مي‌دهد، اما گياهان به‌طورمستقيم قادر به استفاده از آن نيستند. تثبيت ازت توسط باكتري‌ها از دو طريق در گياهان لگوم (تيره‌ي بقولات) توسط باكتري‌هاي گروه ريزوبيوم با ايجاد گره و به‌طور همزيست و در گياهان غيرلگوم به‌كمك باكتري‌هاي گروه ازتوباكتر بدون ايجاد گره و به‌طور غيرهمزيست انجام مي‌شود.
2- حل كردن فسفات: اين باکتريها به كمك آنزيم‌هاي فسفاتاز خارج سلولي فسفات‌هاي آلي را به تركيبات معدني تبديل مي‌كنند.
3- افزايش دسترسي به آهن: گروهي از باكتري‌ها به كمك تركيباتي تشكيل كمپلكس‌هايي با آهن سه ظرفيتي داده كه قابليت جذب توسط گياه را دارند و درون گياه به كمك آنزيم‌هاي احياءكننده ردوكتاز آهن سه ظرفيتي تبديل به آهن دو ظرفيتي مي‌شود.
4- اكسايش گوگرد: در باكتري Thiobacillus ferrooxidans مشاهده مي‌شود كه سبب حلاليت مستقيم تركيبات گوگردي هم‌چون سولفيد آهن مي‌شود.
5- حلاليت فلزات سنگين: گروهي از باكتري‌هاي تيوباسيل داراي توانايي افزايش حلاليت سولفيدهاي فلزات سنگين به‌طور مستقيم و غيرمستقيم هستند.



قیمت: تومان


دیدگاهتان را بنویسید