دانشگاه آزاد اسلامي واحد رشت
دانشکدهي کشاورزي-گروه باغباني
پاياننامه جهت اخذ مدرک کارشناسي ارشد (M.Sc)
عنوان تحقيق:
بررسي ريزازديادي گل آلسترومريا رقم fuego با استفاده از جنين زايي سوماتيک و اندام زايي
استاد راهنما
دکتر بهزاد کاوياني
استاد مشاور
دکتر محمدنقي پاداشت دهکايي

نگارش
سيدرحيم سيد يوسفي

زمستان 1391
.
سپاسگزاري با حمد و سپاس از درگاه ايزدمنان، که هرچه هست و نيست از اوست و از سر رحمت و حکمت او. ا کنون که با استعانت از خداوند متعال نگارش پاياننامه به اتمام رسيده است، بر خود لازم ميدانم که قدردان و سپاسگزار زحمات بيشائبه، توجه و راهنماييهاي خالصانه و تشويقهاي همهجانبه و بهموقع استاد راهنما و مشاور گراميم آقاي دکتر بهزاد کاوياني و دکتر محمد نقي پاداشت که علاوه بر ايفاي نقش استادي، اُسوهي اخلاقي هم محسوب ميشوند، باشم. از خانواده عزيزم که در فرازو نشيب هاي اين راه همواره مشوق من بودند از صميم قلب سپاسگزارم و سلامتي و سربلندي آنها را از خداوند متعال خواستارم.و در نهايت لازم ميدانم از همکاريهاي بيدريغ دوستان عزيزم که در همه مراحل انجام اين تحقيق همراه و همدلم بودند، تشکر و قدرداني نمايم.

سيدرحيم سيد يوسفي
اسفند ماه 1391

فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکيده1
فصل اول: مقدمه و کليات
1-1- مقدمه3
1-2- تاريخچه آلسترومريا4
1-3- مشخصات گياه‌شناسي آلسترومريا6
1-4- روش‌هاي تکثير آلسترومريا…8
1-4-1- تکثير جنسي…………8
1-4-2- تکثير از طريق رويشي8
1-4-3- تکثير از طريق کشت بافت9
1-5- اهميت و جايگاه آلسترومريا به عنوان يک گل شاخه بريده10
1-6-کشت بافت11
1-6-1- محيط کشت و مواد غذايي مورد نياز براي رشد11
1-6-1-1- مواد غذايي غير آلي11
1-6-1-2- مواد غذايي آلي12
1-6-1-3- تنظيم کننده‌هاي رشد گياهي13
1-6-2- زغال فعال14
1-6-3- ريزازديادي15
1-6-4- کشت مريستم‌16
1-7- ضرورت و اهميت اجراي تحقيق19
فصل دوم :مرور منابع
2-1- انتخاب ريزنمونه و ترکيب محيط کشت21
2-2- دما و نور26
2-3- جنين زايي سوماتيکي27
فصل سوم :مواد و روش‌ها
3-1- تهيه مواد گياهي32
3-2- ريزازديادي32
3-2-1- گند زدايي ريزوم‌ها32
3-2-2- محيط کشت تکثير33
3-2-3- تهيه و کشت ريزنمونه34
3-2-4- طرح آزمايشي و تجزيه و تحليل آماري34
3-3- جنين زايي سوماتيک36
3-3-1- تهيه محيط القاء کالوس36
3-3-2- ضدعفوني نمونه‌ها36
3-3-3- تهيه و کشت ريزنمونه گره و ميانگره37
3-3-4- محيط پرآوري کالوس37
3-3-5- محيط کشت باززايي38
3-3-6- طرح آزمايش و تجزيه و تحليل آماري38
فصل چهارم :نتايج و بحث
4-1- نتايج حاصل از آزمايشات صورت گرفته بر روي ريزازديادي آلسترومريا رقم Fuego.40
4-1-1- نتايج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روي تعداد جوانه45
4-1-2- نتايج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روي تعداد شاخه47
4-1-3- نتايج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روي طول شاخه49
4-1-4- نتايج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روي تعداد ريشه51
4-1-5- نتايج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روي طول ريشه54
4-1-6- نتايج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روي تعداد ريزوم56
4-2- نتايج حاصل از آزمايشات جنين زايي سوماتيک صورت گرفته در محيط کشت MS59
4-2-1- مرحله القاء کالوس60
4-2-1-1- اثر نوع ريزنمونه بر کالوس زايي61
4-2-1-2- اثر BAP بر کالوس زايي62
3-2-1-3- اثر NAA بر کالوس زايي63
4-2-1-4- اثر متقابل نوع ريزنمونه و نوع BAP بر کالوس زايي64
4-2-1-5- اثر متقابل نوع ريزنمونه و نوع NAA بر کالوس زايي64
4-2-1-6- اثر متقابل نوع BAP و نوع NAA بر کالوس زايي65
4-2-1-7- مقايسه تيمارهاي اعمال شده با تيمار شاهد66
4-2-2- پرآوري کالوس66
4-2-4- بحث و نتيجه گيري67
منابع69
فهرست جداول

عنوان صفحه
جدول 3-1- غلظت عناصر در محيط کشت MS33
جدول 4-1- تجزيه واريانس اثر سطوح مختلف BAP و NAA روي صفات اندازه گيري شده در کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego42
جدول 4-2- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف BAP بر صفات اندازه گيري شده در کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego43
جدول 4-3- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف NAA بر صفات اندازه گيري شده در کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego43
جدول 4-4- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف NAA و BAP بر صفات اندازه گيري شده در کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego44
جدول 4-5- تجزيه واريانس اثر نوع ريزنمونه، BAP و NAA روي صفات اندازه گيري شده در جنين زايي رويشي آلسترومريا رقم Fuego61
جدول 4-6- مقايسه ميانگين اثر نوع ريزنمونه بر صفات اندازه گيري شده در جنين زايي رويشي گل آلسترومريا62
جدول 4-7- مقايسه ميانگين اثر BAP بر صفات اندازه گيري شده در جنين زايي رويشي گل آلسترومريا63
جدول 4-8- مقايسه ميانگين اثر NAA بر صفات اندازه گيري شده در جنين زايي رويشي گل آلسترومريا63
جدول 4-9- مقايسه ميانگين اثر متقابل نوع ريزنمونه و BAP بر صفات اندازه گيري شده در جنين زايي رويشي گل آلسترومريا64
جدول 4-10- مقايسه ميانگين اثر متقابل نوع ريزنمونه و NAA بر صفات اندازه گيري شده در جنين زايي رويشي گل آلسترومريا65
جدول 4-11- مقايسه ميانگين اثر متقابل BAP و NAA بر صفات اندازه گيري شده در جنين زايي رويشي گل آلسترومريا65
فهرست اشکال

عنوان صفحه

شکل 1-1- نمونه‌هايي از گل آلسترومريا5
شکل 1-2- گل آلسترومريا رقم Fuego5
شکل 1-3- شمايي از گل آلسترومريا6
شکل 1-4- شماي از شکل ريزوم که در آن ريشه‌ها و شاخه‌هاي هوايي منشا مي‌گيرند7
شکل 4-1- نحوه تهيه ريزنمونه نوک ريزوم (الف)، رشد ريزنمونه‌ها و توليد شاخساره در هفته چهارم (ب) و ريشه‌دار شدن گياهچه‌ها در هفته ششم (ج)41
شکل 4-2- نمايي از کشت ريزنمونه گل آلسترومريا42
شکل 4-3- تشکيل کالوس توده‌اي (الف) و کروي (ب) در گل آلسترومريا60

فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار 4-1- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف BAP روي تعداد جوانه حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego46
نمودار 4-2- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف NAA روي تعداد جوانه حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego46
نمودار 4-3- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف BAP روي تعداد شاخساره حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego48
نمودار 4-4- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف NAA روي تعداد شاخساره حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego48
نمودار 4-5- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف BAP روي طول شاخساره حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego50
نمودار 4-6- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف NAA روي طول شاخساره حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego51
نمودار 4-7- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف BAP روي تعداد ريشه حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego52
نمودار 4-8- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف NAA روي تعداد ريشه حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego53
نمودار 4-9- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف BAP روي طول ريشه حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego55
نمودار 4-10- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف NAA روي طول ريشه حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego56
نمودار 4-11- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف BAP روي تعداد ريزوم حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego57
نمودار 4-12- مقايسه ميانگين اثر سطوح مختلف NAA روي تعداد ريزوم حاصل از کشت جوانه ريزوم آلسترومريا رقم Fuego58

چکيده

گل آلسترومريا با نام علمي(Alstroemeria psittacina)از خانواده ((Alstroemeriaceaeيکي از مهم ترين گلهاي شاخه بريده در دنيا بوده که اخيراً براي توليد گلهاي گلداني و باغچه اي نيز استفاده مي شود. اين تحقيق به منظور بررسي و معرفي محيطي مناسب جهت ريزازديادي و توليد کالوس هاي جنيني و جنين زايي سوماتيکي آلسترومريا انجام شد.
در بخش ريزازديادي، جوانه هاي جانبي و انتهايي ريزوم به طول mm 6-4 از رقم فيگو پس از گندزايي بر روي محيط کشت MS حاوي 30 گرم در ليتر ساکارز، 7 گرم در ليتر آگار و غلظت هاي مختلف BAP و NAA کشت شدند و به فواصل هر 3 هفته واکشت شدند. جوانه هاي کشت شده از هفته سوم شروع به رشد نمودند. بيشترين تعداد شاخساره از محيط کشت حاوي 1 ميلي گرم در ليتر BAP و 2/0 ميلي گرم در ليتر NAA حاصل شد. همچنين نتايج نشان داد که با افزايش غلظت BAP به دليل کاهش اثر غالبيت انتهايي، طول شاخساره ها کاهش يافته است. همچنين مقدار کم NAA جهت رشد شاخساره و ريزوم هاي اوليه ضروري بوده است. از آنجايي که در تکثير آلسترومريا، تعداد ريزوم تکثير يافته از تعداد شاخساره مهم تر مي باشد، درنتيجه محيط کشت حاوي صفر ميلي گرم در ليتر BAP و 1 ميلي گرم در ليتر NAA با ميانگين تعداد 3 ريزوم و 5 ريشه در هر ريزنمونه بهترين تيمار براي ريزازديادي آلسترومريا رقم فيگو بوده است.
آزمايشات جنين زايي سوماتيک نيز در محيط کشت MS انجام شد. در اين محيط کشت به منظور به دست آوردن کالوس هاي جنين زا، ريزنمونه هاي رويشي (گره و ميانگره) و هورمون اکسين NAA در دو سطح (غلظت 1 و 2 ميلي گرم در ليتر) همراه با تنظيم کننده رشد سايتوکنين BAP در دو سطح (غلظت 0 و 5/0 ميلي گرم در ليتر) مورد استفاده قرار گرفت. بهترين ريزنمونه جهت بدست آوردن کالوس هاي جنين زا، گره ها بودند. ريزنمونه هاي ميانگره اگرچه مستعد توليد کالوس هاي جنيني بودند اما در مقايسه با گره ها داراي درصد کالوس زايي پائين تري بودند. بهترين تيمار هورموني براي بدست آوردن کالوس هاي جنين زا، 2 ميلي گرم در ليتر NAA بوده است. کالوس هاي به دست آمده، 3 ماه پس از کشت جهت پرآوري به محيط کشت MS تغيير داده شده حاوي 5 ميلي گرم در ليتر پيکلرام منتقل شدند. جنين زايي سوماتيک و باززايي گياه از اين جنين ها، پس از انتقال کالوس هاي جنيني توده اي به محيط کشت باززايي حاوي غلظت هاي مختلف BAP صورت گرفت. بيشترين گياهچه از محيط کشت MS حاوي 5/0 ميلي گرم در ليتر BAP حاصل شد.
کلمات کليدي:آلسترومريا، ريزازديادي، جنين زايي سوماتيک، نفتالين استيک اسيد، بنزيل آمينو پورين.

فصل اول
مقدمه و کليات
1-1- مقدمه
فناوري کشت بافت و سلول در دومين انقلاب سبز، که بر اساس تغيير ژن و دستکاري ژنتيکي براي بهبود کيفيت و کميت محصولات پايه گذاري شد، نقش کليدي دارد. کشت بافت و سلول گياهي به روشي گفته مي‌شود که اجزاي مختلف گياه شامل سلول، پروتوپلاست، جنين، بافت، اندام و غيره در شرايط آزمايشگاهي و به طور کامل سترون روي يک محيط غذايي قرار مي‌گيرند و در شرايط محيطي مناسب نگهداري مي‌شوند. اين روش در سطح کم وسعت در مقايسه با کشت هاي مزرعه‌اي و با استفاده از محيط غذايي مشخص و عاري از هر گونه آلودگي صورت مي‌گيرد .
روش‌هاي اصلي براي ايجاد کالوس‌دهي و باززايي، شامل روش‌هايي است که هم کاربرد تجاري مستقيم دارند و به همان اندازه نيز امکان پژوهش‌هاي پايه‌هاي ژنتيکي و بيو شيميايي در سلول را فراهم مي‌آورند. اين روش‌ها شامل انواع کشت بافت و سلول‌هاي گياهي، مانند بساک، تخمک (تخمدان)، بذر، ساقه، برگ، کالوس، جداسازي پروتوپلاست و امتزاج آنها، انتخاب سلول، کشت مريستم و جوانه، و همچنين تغيير ژنتيکي سلول‌ها و گياهان است (سيد طباطبايي و اميدي، 1388).
امروزه از تکنيک‌هاي کشت بافت در سراسر جهان به منظور توليد بسياري از گياهان با اهداف گوناگون استفاده مي‌شود. اين تکنيک‌ها دامنه وسيعي از روش‌هاي مختلف را بسته به محيط‌هاي کشت مورد استفاده، ريزنمونه مورد نظر، چگونگي انتقال از فازهاي مختلف فرآيند و … را در بر مي‌گيرند.
يکي از مهم‌ترين روش‌هاي کشت بافت، ريزازديادي است که به منظور تکثير انبوه گياهان در زماني کوتاه به کار مي‌رود. در اين روش از قسمت‌هاي مختلف گياه ريزنمونه تهيه شده و با استفاده از ترکيبات غذايي و هورموني مناسب مستقيماً به فاز باززايي هدايت مي‌شوند. در واقع اين تکنيک مي‌تواند جايگزيني براي روش‌هاي سنتي تکثير غير جنسي در بسياري از گياهان باشد.
يک روش بسيار پرکاربرد ريزازديادي کشت مريستم و نوک ساقه است. مريستم شامل سلول‌هاي به سرعت در حال تقسيم است، از اين رو از اين تکنيک براي توليد تجاري گياهان و همين طور توليد گياهان عاري از ويروس به طور وسيعي استفاده مي‌شود. گياهان به دست آمده از اين طريق، پايداري ژنتيکي زيادي نشان مي‌دهند، از اين رو براي انجام تحقيقات بيوتکنولوژيکي بسيار مناسب هستند.

1-2- تاريخچه آلسترومريا
آلسترومريا (Alstromeria sp.)که در ايران با نام سوسن پرويي نيز خوانده مي شود، گياهي دگرگشن بوده که خاستگاه آن آمريکاي جنوبي است. اين جنس داراي گونه‌هاي فراواني در خانواده آلسترومرياسه است که امروزه تعدادي از آنها به عنوان گياهان زينتي براي توليد گل‌هاي شاخه بريده، گياهان باغي، باغچه‌اي و يا گلداني پرورش داده مي‌شوند) باند و الدرسون، 1993).
درحال حاضر آلسترومريا به علت داشتن گل‌هاي زيبا و بادوام در بازارهاي جهاني گل و گياه به عنوان يکي از مهم‌ترين و پرطرفدارترين گل‌هاي زينتي شاخه بريده به شمار مي‌رود (خالقي و همکاران، 2008).
آلسترومريا به طور معمول با استفاده از ريزوم تکثير مي‌شود، اما آلودگي‌هاي ويروسي، سرعت کم تکثير و محدوديت‌هاي فصلي، سبب محدود شدن استفاده از اين روش شده است (وان و همکاران، 1996).

شکل 1-1- نمونه‌هايي از گل آلسترومريا

شکل 1-2- گل آلسترومريا رقم Fuego

درحال حاضر براي فايق آمدن بر مشکلات روش‌هاي معمول تکثير اين گياه زينتي و توليد گياهان عاري از ويروس، استفاده از روش‌هاي کشت درون شيشه‌اي در اين گياه اهميت زيادي پيدا کرده است. براي تکثير اين‌ويتروي آلسترومريا معمولاً از ريزنمونه‌هاي جوانه انتهايي شاخه (پدراز سانتوز و همکاران،2005)، جوانه جانبي (لين و همکاران، 1997) و ريزوم (لين و همکاران، 1987) استفاده مي‌گردد. با اين وجود سرعت باززايي جوانه انتهايي ريزوم (نوک ريزوم) از ساير ريزنمونه‌ها بيشتر گزارش شده است (لين و همکاران، 1987).

1-3- مشخصات گياه‌شناسي آلسترومريا
آلسترمريا (Alstromeria) از گياهان زير رده تک لپه‌ايها متعلق به خانواده آلسترومرياسه مي‌باشد. آلسترومريا گياهي است علفي، چند ساله، ريزوم دار با گلهايي به رنگ‌هاي مختلف که حدود 60 گونه دارد که منشا همگي از جنوب آمريکا مي‌باشد (بيکر، 1888؛ آفوت، 1952؛ رابينسون، 1963). آلسترومريا داراي انواع مختلفي مي‌باشند که مي‌توانند در شرايط گوناگوني همچون سواحل شني (A.peregrina L.)، بيابانها (A.Violacea phil)، جلگه‌هاي آبرفتي (A.heamantha Ruiz)، دشتهاي نيمه جنگلي (A.aurantiaca D.Don ) و مناطق سرد کوهستاني (A. Nivalis phil. In Lin) رشد و نمو کنند (هنس و ويلکينز، 1979 ). اين گياه داراي ريزوم‌هاي سفيدي مي‌باشد که از آن شاخه‌هاي هوايي منشا مي‌گيرند. شاخه‌ها بسته به دماي خاک، طول روز و شدت نور مي‌توانند بصورت رويشي يا زايشي باشند (وانک نورديروف، 1975؛ هيلي و همکاران، 1982).
گل‌ها در انتهاي ساقه به صورت گل‌آذين گرزن تشکيل مي‌شوند که هر گل‌آذين بسته به فصل رشد، شدت نور، و اندازه و قدرت رشدي گياه بيش از 4 گلچه دارد (هيوز و همکاران، 1986). گل‌ها به رنگ‌هاي مختلفي از زرد تا قرمز، ديپلوئيد و داراي 2n=16 کروموزوم و ناهمرس مي‌باشند، يعني قبل از اينکه کلاله پذيرا گردد پرچم‌ها باز شده و دانه‌هاي گرده خود را رها مي‌کنند (دارلينگتون و وايلي، 1955). در ميان کولتيوارها، تتراپلوئيد نيز وجود دارد. برگها نيز به صورت متناوب با لبه صاف مي‌باشند (پاول و همکاران، 1986 ).

شکل 1-3- شمايي از گل آلسترومريا

آلسترومريا داراي يك ريزوم زيرزميني است كه از آن شاخه‌هاي عمودي رشد و نمو مي‌نمايند. ريزوم اصلي عموماً ريزومهاي جانبي جديدي توليد مي‌نمايد كه آن شاخه گل‌دهنده را توليد مي‌نمايد، در سطح خاك شاخه‌ها توليد هيچ شاخه جانبي نمي‌نمايند بنابراين اكثر قسمت‌هاي گياه در زيرزمين توسعه پيدا مي‌كند دماي خاك نقش مهمي را در اين توسعه ايفا مي‌نمايد. بعد ازيك دوره دماي بالاي خاك، گياه شاخه‌هاي زيادي توليد مي‌نمايد (ريزوم جديد) که بسته به نوع واريته بسياري از اين شاخه‌ها باقي مي‌‌مانند (توليد گل نمي‌نمايند).
يك شاخه آلسترومريا از هر يك ازجوانه‌هاي جانبي نزديك نوك شاخه،7-3 شاخه گل توليد مي‌نمايد انواع مختلف آلسترومريا وجود دارد (اركيده – پروانه اي و آئورا نتيكا) اما اكثر گونه‌هاي امروزي هيبريد هستند گرچه در طول مدت سال توليد مي‌نمايند ولي پيك آن در بهار و اغلب در پائيز است وقتي كه خاك مصرفي( بستر كشت) سرد است.

شکل 1-4- شماي از شکل ريزوم که در آن ريشه‌ها و شاخه‌هاي هوايي منشا مي‌گيرند.

1-4- روش‌هاي تکثير آلسترومريا
1-4-1- تکثير جنسي
به طور معمول از تکثير آلسترومريا به وسيله بذر به علت تغيير پذيري ژنتيکي و مشکلات جوانه‌زني بذر که وجود دارد بايد پرهيز کرد. بذرها بعلت گران نبودن و ازدياد سريع مزيت دارند. بذرهايي که يک سال از برداشت آنها گذشته، اگر چهار هفته در شرايط مرطوب و گرم (18 تا 25 درجه سانتي گراد) قرار گرفته و بعد چهار هفته در شرايط مرطوب و سرد (7 درجه سانتي‌گراد) قرار گيرند، طي هشت تا ده هفته جوانه خواهند زد. براي کثير آلسترومريا، از بذر کمتر استفاده مي‌شود خصوصاً اينکه تکثير از اين طريق سبب ايجاد تفرق صفات مي‌گردد (ناصري، 1377).
1-4-2- تکثير از طريق رويشي
گياهان آلسترومريا، به طور معمول از طريق رويشي توسط تقسيم ريزوم تکثير مي‌شوند. معمولاً گياهان را در ماههاي شهريور و مهر از زمين خارج مي‌کنند. بايستي مراقب بود که جوانه‌هاي جانبي و انتهايي ريزوم و همچنين ريشه‌ها آسيبي نبينند. سپس ريزوم‌ها را به قطعات 5 سانتي متري که حاوي جوانه جانبي يا انتهايي باشند تقسيم مي‌کنند. بسترهاي کشت بايستي از قبل آماده شده باشند تا تقسيم و کشت بعدي گياهان به سرعت انجام شود. جهت کنترل بيماري‌ها، توصيه شده که ريزوم‌ها در زمان کشت با قارچ کشها ضدعفوني شوند. پس از کشت، تنها زماني که بستر کشت خشک شد آبياري انجام مي‌شود زيرا آبياري و رطوبت بيش از حد موجب پوسيدگي ريزوم‌ها مي‌گردد. معمولاً پس از 4 تا 8 هفته در دماي 18 درجه سانتي‌گراد ريزوم‌ها کاملاً مستقر مي‌شوند. بعد از اين دوره، دما را به 5/4 درجه سانتي‌گراد به مدت 4 تا 6 هفته کاهش مي‌دهند تا عمل بهاره‌سازي ريزوم‌ها صورت گيرد و گلدهي تحريک گردد (هيلي و ويلکينز، 1981).

1-4-3- تکثير از طريق کشت بافت
تکثير به روش تقسيم ريزوم داراي معايبي مي‌باشد، از جمله اينکه اين روش فرآيندي وقت گير، درصد افزايش نسبتاً پائين، پرهزينه و باعث گسترش بيماريهاي ويروسي مي‌گردد. به همين دليل در سال‌هاي اخير سيستم‌هاي ريزازديادي درون شيشه‌اي توسعه پيدا کرده است (لين و همکاران، 2000). در اين روش از قسمت‌هاي مختلف اندام‌هاي رويشي، خصوصاً جوانه‌هاي انتهايي و جانبي ريزوم، به عنوان ريزنمونه جهت تکثير استفاده مي‌شود.

1-5- اهميت و جايگاه آلسترومريا به عنوان يک گل شاخه بريده

گونه‌هاي وحشي آلسترومريا بطور معمول براي توليد گل‌هاي شاخه بريده تجاري مناسب نيستند. آنها داراي دوره گلدهي کوتاه و برگ‌هايي با کيفيت پائين مي‌باشند. با اين حال، کولتيوارها و هيبريدهاي تجاري از طريق تلاقي‌هاي بين گونه‌اي و تيمارهاي پرتوافکني بدست آمده‌اند (گومانس، 1962؛ برورتجس و وربوم، 1974 ).

آلسترمرياهاي جديد بدليل داشتن گل‌هاي درشت با تنوع وسيعي از رنگ‌ها و تشکيل گل‌هايي زيبا با طول عمر پس از برداشت بالا (تا حدود 14 روز) بسيار با ارزش مي‌باشند (هيلي و ويلکينز، 1981).
در حال حاضر، آلسترومريا در بين گل‌هاي شاخه بريده يکي از مهم‌ترين گل‌ها در يازارهاي جهاني مي‌باشد. در کشور هلند به تنهاي بيش از 118 هکتار تحت کشت آلسترومريا مي‌باشد. در ايران نيز آلسترومريا بعنوان يک محصول جديد بوده که سطح زير کشت و خريداران اين گل در بازار رو به افزايش است. بطوري که در شش ماهه اول سال 1384، 46320 اندام تکثير (ريزوم) به قيمت حدود 300 ميليون تومان وارد ايران گرديده است (گزارش ساليانه مرکز ملي تحقيقات گل و گياهان زينتي ايران، 85-1384).
1-6-کشت بافت
کشت بافت و سلول گياهي، کشت سلول‌ها، بافت‌ها و اندام‌هاي گياهي را تحت شرايط استريل و در محيط‌هاي کنترل شده در بر مي‌گيرد. تکنولوژي کشت بافت و سلول گياهي (که کشت in vitro نيز گفته مي شود) بر اساس انواع روش‌هايي که دامنه‌اي از کشت پروتوپلاست‌ها تا باززايي و تکثير همسانه‌اي گياهان کامل را شامل مي‌شوند، قرار دارد. توانايي پرورش سلول‌ها و بافت‌هاي گياهي در محيط کشت و منتقل نمودن آنها، پايه بسياري از کاربردهاي عملي اين تکنيک را در کشاورزي تشکيل مي‌دهد و يک پيش نياز براي مهندسي ژنتيک گياهي است (اتوس و همکاران، 2005).
1-6-1- محيط کشت و مواد غذايي مورد نياز براي رشد
کاربرد موفق روش‌هاي کشت بافت به طور عمده به محيط کشت با ترکيبات درست وابسته است. علاوه بر ترکيب، کار مهم ديگر محيط کشت اين است که محيط فيزيکي مناسبي براي رشد سلول‌ها و بافت‌ها فراهم کند. نيازهاي غذايي کشت بافت گياهي مي تواند به سه گروه تقسيم گردد: مواد غذايي غير آلي (معدني)، مواد غذايي آلي و تنظيم کننده‌هاي رشد گياهي (اتوس و همکاران، 2005).

1-6-1-1- مواد غذايي غير آلي
اين مواد بر اساس غلظت مورد استفاده‌شان به دو گروه تقسيم مي شوند: درشت مغذي‌ها و ريزمغذي‌ها. بر اساس نظريات انجمن بين المللي فيزيولوژي گياهي، عناصري که در غلظت‌هاي بيش از 5/0 ميلي مول بر ليتر مورد نياز گياه باشند، درشت مغذي‌ها و عناصري که در کمتر از اين غلظت مورد نياز گياه باشند، ريزمغذي‌ها ناميده مي‌شوند (اتوس و همکاران، 2005).
انتخاب مخلوط نمک‌هاي درشت مغذي و ريزمغذي، شديداً به گياه مورد مطالعه بستگي دارد. کاربرد محيط کشت موراشيگ و اسکوگ يا MS به دليل اينکه بسياري از گياهان به آن عکس‌العمل مناسبي نشان مي‌دهند، بسيار متداول است. در هر حال بايد توجه داشت که اين محيط کشت الزاماً هميشه براي رشد و نمو، ايده آل نيست، زيرا ميزان نمک در آن خيلي بالاست (باقري، 1376).
درشت مغذي‌هاي استفاده شده در محيط کشت، نيتروژن (N)، گوگرد (S)، فسفر(P)، کلسيم(Ca)، منيزيم(Mg) و پتاسيم(K) را در بر مي‌گيرند. ريزمغذي‌هاي مورد نياز در محيط کشت شامل آهن (Fe)، بر (B)، کوبالت (Co)، مس (Cu)، يد (I)، منگنز (Mn)، موليبدن (Mo) و روي (Zn) مي‌باشد.

1-6-1-2- مواد غذايي آلي
يک جزء مهم همه محيط‌هاي کشت، منبع انرژي است که به اين منظور ساکارز به طور وسيعي استفاده مي‌شود. در واقع ساکارز رايج ترين قند مورد استفاده در محيط کشت گياهي است، اما گلوکز، فروکتوز و سوربيتول نيز در برخي فرمولاسيون‌ها به کار مي‌روند. ساکارز علاوه بر نقش متابوليکي‌اش، به عنوان يک اسموتيکوم عمل کرده و به همراه عناصر غذايي غير آلي، به تعادل پتانسيل اسمزي محيط کشت کمک مي‌کند (اوانس و همکاران، 2003).
معمولاً در کشت in vitro از ساکارز با غلظت 1 تا 5 درصد استفاده مي‌شود. غلظت قند انتخاب شده، بستگي زيادي به نوع و سن مواد در حال رشد دارد. به عنوان مثال جنين‌هاي بسيار جوان، به نسبت بسيار بالايي از قند احتياج دارند (باقري، 1376).
ويتامين‌ها براي کشت بافت ضروري نيستند، هرچند ويتامين B1 (تيامين) تصور مي شود براي کشت برخي گونه‌ها سودمنذ باشد. به هر حال بيوتين، اسيد پانتوتنيک، اسيد نيکوتينيک (نياسين)، پيريدوکسين (ويتامين B6)، اسيد فوليک، اسيد آسکوربيک (ويتامين C) و ويتامين E به برخي محيط‌هاي کشت افزوده مي‌گردد. الکل قندي ميواينوزيتول به وفور براي تک لپه‌ايها، بازدانگان و برخي دو لپه‌ايها در محيط کشت به کار مي‌رود.

1-6-1-3- تنظيم کننده‌هاي رشد گياهي
توسعه کشت بافت به عنوان يک دانش پايه، به طور نزديکي با کشف و شناسايي تنظيم کننده‌هاي رشد گياهي در ارتباط است (اوانس و همکاران، 2003).
يک دسته از تنظيم کننده‌هاي رشد گياهي، اکسين‌ها هستند. اکسين عمده در گياهان ايندول-3- اسيد استيک (IAA) مي‌باشد. کاربرد اساسي اکسين تحريک رشد طولي سلول‌هاست. در کشت بافت گياهي، اکسين به همراه سيتوکنين براي کنترل تمايز و اندام زايي به کار مي‌رود. اکسين‌هاي طبيعي به ندرت در کشت بافت استفاده مي شوند و اکسين‌هاي ساختگي يعني 2،4-ديکلوروفنوکسي استيک اسيد (2,4-D)، 1-نفتالين استيک اسيد (NAA) و ايندول بوتيريک استيک اسيد (IBA) رايج ترين جايگزين‌ها هستند (اوانس و همکاران، 2003). استفاده از 2,4-D مي‌تواند مانع از فتوسنتز شود. درحاليکه در استفاده از اکسين‌هاي NAA، IBA و IAA چنين اتفاقي نمي‌افتد (باقري، 1376).
در غلظت کم اکسين، تشکيل ريشه‌هاي نا بجا حالت غالب دارد. درحاليکه در غلظت‌هاي زياد اکسين، تشکيل ريشه صورت نمي‌گيرد و تشکيل کالوس اتفاق مي‌افتد (باقري، 1376).
دسته ديگر تنظيم کننده‌هاي رشد گياهي، سيتوکنين‌ها مي باشند. سيتوکنين‌ها رشد و نمو را توسعه مي‌دهند، پيري را به تاخير مي‌اندازند و به همراه اکسين‌ها براي کنترل رشد و نمو به کار مي‌روند. اولين سيتوکنيني که شناسايي شد، کاينتين بود، پس از آن زآتين از دانه ذرت جدا شد. رايج‌ترين سيتوکنين‌هاي به کار رفته در کشت بافت، کاينتين، بنزيل آمينو پورين (BAP يا BA)، زآتين و آدنين را شامل مي‌شوند. آدنين براي اولين بار توسط اسکوگ و توي (1984) در رشد ساقه ريزنمونه‌هاي توتون به کار برده شد و باعث تحريک تشکيل ساقه نابجا شد.
نيچ و همکاران (1967) نيز از آدنين براي تسريع در تشکيل ساقه‌هاي نابجا استفاده کردند. اين ماده براي تکثير رويشي گياهان در غلظت‌هاي 2 تا 120 ميلي گرم در ليتر به کار مي‌رود. از آدنين سولفات مي‌توان به جاي آدنين استفاده کرد، چون در آب بيشتر حل مي‌شود (باقري، 1376).
گروهي ديگر از تنظيم کننده‌هاي رشد ، جيبرلين‌ها هستند. در گياهان عمل اصلي جيبرلين‌ها تحريک طويل شدن ساقه و گلدهي است. جيبرلين‌ها همچنين در تحرک ذخاير غذايي از آندوسپرم در مراحل آغازين رشد جنين و جوانه‌زني بذرهاي غلات شرکت دارند. جيبرلين‌ها يک خانواده شيميايي بسيار بزرگ با بيش از 90 جيبرلين مختلف شناخته شده در گياهان هستند. در کشت بافت گياهي، جيبرلين‌ها براي القاء اندام‌زايي به کار مي‌روند. تنها GA3، GA4 و GA7 در کشت‌هاي گياهي رايج هستند (اوانس و همکاران، 2003؛ فارسي و ذوالعلي، 1382).
1-6-2- زغال فعال
زغال فعال ماده‌اي داراي شبکه بسيار ظريف از سوراخ‌ها با يک سطح داخلي بزرگ است که بسياري مواد مي‌توانند بر روي آن جذب شوند. اين ماده اغلب در کشت بافت به منظور بهبود رشد و نمو سلول به کار مي‌رود. زغال فعال با جذب غير قابل برگشت ترکيبات بازدارنده در محيط کشت در واقع موجب کاهش متابوليت‌هاي سمي مي‌گردد. از طرف ديگر در جذب موادي مثل ويتامينه‌ها، آهن، و برخي هورمون‌ها به گياه کمک مي‌کند (توماس، 2008).
اثرات زغال فعال بر پاسخ بافت در کشت in vitro به نظر مي‌رسد نه تنها به نوع زغال فعال و درجه فعاليت آن، بلکه به گونه‌هاي گياهي کشت شده بستگي دارد. افزودن زغال فعال به محيط کشت ممکن است بسته به محيط کشت، بافت مورد استفاده و يا اهداف محقق، اثر مثبت يا منفي بر رشد و نمو داشته باشد (پان و استادن، 1998).

1-6-3- ريزازديادي
يکي از تکنيک‌هاي کشت بافت، ريزازديادي است. تکثر کلون در شرايط in vitro را ريز ازديادي نامند. تکثير کلون عبارت است از ازدياد افرادي با محتواي ژنتيکي کاملاً مشابه با استفاده از توليد مثل غير جنسي و کلون، جمعيتي از گياهان است که از يک گياه منفرد به وسيله توليد مثل غير جنسي به وجود آمده است (فارسي و ذوالعلي، 1382).
مزيت مهم استفاده از روش‌هاي تکثير کلون در شرايط استريل (ريزازديادي) نسبت به روش‌هاي مرسوم اين است که در زمان و فضاي نسبتاً محدود، از يک فرد مي‌توان جمعيت بزرگي به دست آورد. تخمين زده شده است که روش تکثير جوانه جانبي، تعداد ساقه را در هر دوره يک ماهه کشت به طور متوسط تا 10 برابر افزايش مي‌دهد و در يک دوره شش ماهه امکان توليد بيش از يک ميليون واحد تکثيري يا گياه از يک ريزنمونه وجود دارد (فارسي و ذوالعلي، 1382).
تکنيک‌هاي ريزازديادي به منظور افزايش سريع تعداد افراد در گونه‌هاي با مشکلات توليد مثلي و يا با جمعيت‌هاي بسيار کاهش يافته به کار مي‌روند. مثال‌هاي متعددي وجود دارد که در آنها ريزازديادي، امکان افزايش در تعداد افراد را در شرايط ex situe براي قطع فشار جمع آوري در طبيعت هم به وسيله عموم و هم به وسيله محققان فراهم مي‌سازد (يا خواهد ساخت) (بنتو و مارتين، 2010).
مزيت ديگري از تکنيک‌هاي کشتin vitro اين است که مي‌توانند جايگزيني براي بانک‌هاي بذر با گونه‌‌هاي بسيار محدود، که در آنها عمل ساده جمع‌آوري بذر در جمعيت طبيعي ممکن است بر بقاي آن تاثير بگذارد، يا با گونه‌هاي با موفقيت تکثير جنسي پائين باشند (بنتو و مارتين، 2010).
موراشينگ در سال 1974 سه مرحله اصلي فرآيند ريزازديادي را طراحي نمود:
مرحله 1- انتخاب ريزنمونه‌هاي مناسب، استريليزاسيون و انتقال آنها به محيط کشت غذايي به منظور تثبيت (شروع کشت استريل).
مرحله 2- توليد يا تکثير ساقه‌ها از ريزنمونه‌هاي موجود در محيط کشت.
مرحله 3- انتقال ساقه‌ها به يک محيط کشت ريشه‌دهي و سپس انتقال آنها به خاک.
البته تکثير in vitro تمام گونه‌ها مستلزم اجراي هر سه مرحله نيست و اين مراحل فقط به منظور توصيف فرآيندهاي ريزازديادي و تسهيل مقايسه بين دو يا چند سيستم ارئه شده‌اند (فارسي و ذوالعلي، 1382).

1-6-4- کشت مريستم‌
مريستم‌ها نواحي سلول‌هاي فعال در حال تقسيم هستند که سلول‌هايي را ايجاد مي‌کنند که به بافت‌هاي جديد گياه تمايز مي‌يابند. مريستم‌ها حاوي سلول‌هاي دائمي به نام آغازين‌ها مي‌باشند که توانايي تقسيم و توليد سلول‌هاي جديد را در طول زندگي مريستم حفظ مي‌کنند. مريستم‌هاي انتهايي نزديک نوک ريشه‌ها و ساقه‌ها شکل مي‌گيرند و اساساً مسئول توسعه طول بدنه گياه هستند (اوانس و همکاران، 2003).
رشد ساقه در تمامي نهاندانگان و بازدانگان برخاسته از ويژگي مريستم انتهايي آنهاست. مريستم انتهايي، يک بافت گنبد مانند تقريبي 1/0 ميلي متر و طول تقريبي 25/0 _3/0 ميلي متر مي‌باشند، که در ناحيه انتهايي نوک ساقه قرار دارد. مريستم انتهايي به همراه 1 تا 3 پريمورديا، ساختاري به قطر 1/0 – 5/0 ميلي‌متر که همان نوک ساقه است را تشکيل مي‌دهند.
در کشت مريستم انتهايي، ريزنمونه از گنبد مريستمي انتهايي يا گنبد انتهايي به همراه چند پريموردياي برگ موجود در ناحيه زيرين آن گرفته مي‌شود. مريستم يا نوک ساقه با ايجاد يک برش V شکل با يک چاقوي استريل از ساقه جدا مي شود. براي کشت مريستم انتهايي، برشي در فاصله3/0 -5/0 ميلي متر پائين‌تر از نوک مريستم ايجاد نموده و بافت قطع شده را همراه با مقداري از بافت پيش کامبيومي برداشته و سريعاً به محيط کشت منتقل مي‌کنند (فارسي



قیمت: تومان


پاسخ دهید